3323 J-レカム 2020-12-22 18:10:00
ウイルス除去・除菌装置「ReSPR(レスパー)」によるアルミニウム表面上の新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)の不活化を確認 [pdf]

                                                       2020 年 12 月 22 日

各   位
                              本社所在地 東京都渋谷区代々木3-25-3
                              会 社 名 レ カ ム 株 式 会 社
                              代 表 者 名 代表取締役社長 伊 藤 秀 博
                               (コード番号:3323 東証 JASDAQ S)
                              問 合 せ 先 取締役執行役員CFO
                                             兼財務本部長
                                                    砥 綿 正 博
                                     (TEL:03-4405-4566)
                                     (URL: http://www.recomm.co.jp)



           ウイルス除去・除菌装置「ReSPR(レスパー)     」による
        アルミニウム表面上の新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)の不活化を確認


 レカム株式会社(本社:東京都渋谷区、代表取締役社長 伊藤 秀博)が販売を行っているウイルス
除去・除菌装置「ReSPR」につきまして、米国ウィスコンシン大学獣医学部・オソリオ研究所にお
ける実証実験の結果、新型コロナウイルスの不活化が確認されましたので、お知らせします。

                              記

1.「ウイルス除去・除菌装置「ReSPR」によるアルミニウム表面上の SARS-CoV-2 の不活化を確
 認)」レポートについて
   「ReSPR」の製造元である ReSPR TECHNOLOGIES INC.(本社:パナマ共和国、プレジデント
 Christophe Suchy、以下「ReSPR 社」といいます。  )は、ウイルス除去・除菌装置「ReSPR」に
 よる新型コロナウイルスの不活化を確認するため、2020 年6月中旬に米国ウィスコンシン大学獣医
 学部・オソリオ研究所に実証実験を依頼しました。
  実証実験は、新型コロナウイルスの不活化を 9 月中旬に確認した後、曝露時間を数パターンで評価
 を行うなど、     実験開始から約5か月間かけて実施されました。        米国ウィスコンシン大学獣医学部・オ
 ソリオ研究所では、        2020 年 12 月8日に添付の当該実証実験レポートを公表、同日に ReSPR 社が受領
 しております。当社は、ReSPR 社より 11 日に受領いたしました。当社は、ReSPR 社より同社 HP に実
 証結果を掲載した後に開示することを求められていたことから、本日、お知らせすることとなりま
 した。  なお、  ウィスコンシン大学は 2020 年6月に発表された東京大学、     国立国際医療研究センター、
 国立感染症研究所のネコ間の呼吸器での新型コロナウイルスでの共同研究にも参画しております。

2.業績等に与える影響について
  2021 年9月期連結業績に与える影響については、現在精査中であり、改めて開示の必要が生じた
 場合には速やかに開示いたします。

                                                                  以上




                                                                      1
                                                                                                                            School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory


(和訳)                                                                                   レポート:

                RESPR HVAC装置によるアルミニウム表面上のSARS-CoV-2の不活化
                             クリスチアン・サラス(Cristhian Salas)- ホルヘ・オソリオ(Jorge Osorio)


                                                                                   2020年12月8日



                                                                                             抄録

人間の日常的活動において適用可能な有効なSARS-CoV-2不活化法を設計することで、COVID-19な
どの感染症の伝播や拡大を抑えるのに役立つ可能性がある。RESPR技術は空気中および物体表面
からの病原体やアレルゲンの低減に有効であることが示されている。この技術は酸化粒子を放出し、
人々が吸入する空気を浄化する装置で用いられている。本論ではアルミニウム表面における、様々な
曝露時間での、RESPR HVAC装置のSARS-CoV-2不活化の有効性を検証した。プラークアッセイ法を
用い、装置存在下での8つの曝露時点(10分から2880分まで)後のSARS-CoV-2力価を測定した。
RESPR HVAC装置は、1440分後にアルミニウム表面のSARS-CoV-2感染粒子を99.991%低減したこと
が示された。



                                                                                             目次

抄録 ................................................................................................................................................................................................ 1
材料および方法 ......................................................................................................................................................................... 1
         材料の感染および試料採取 ....................................................................................................................................... 1
         ウイルス不活化の定量 ................................................................................................................................................. 2
         データ解析 ......................................................................................................................................................................... 3
結果 ................................................................................................................................................................................................ 3
結論 ................................................................................................................................................................................................ 4



材料および方法

      材料の感染および試料採取
RESPR HVAC装置をバイオセイフティ・キャビネット(BSC)内に設置し、スイッチを入れた。70%エタノー
ルにより消毒済みの24mm×24mmの滅菌アルミ箔片を25分間UV光に曝露し、BSC内のペトリ皿に個
別に置き、室温で保持した。1×105PFUのSARS-CoV-2の接種液200μLを、マイクロピぺットチップを
用いて各アルミ箔片上に載せて延ばした。各処理毎に複製を3つ調製し、8つの曝露時間(15、30、60、
120、360、720、1440、および2880分)の評価ができるだけの試料を調製した(表1)。




                                                                                                                                                                                                  2
                                                  School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory



各曝露時間の後、2mLの採取媒体(2%FBS含有DMEM)を各ペトリ皿に加え、1:11の初期希釈を調製
し、アルミニウム材料をマイクロピペットを用いて4~5回再懸濁することで洗い流した。ウイルス懸濁液
を採取し、均一性を得るために混合し、1mL遠心管に分注した。採取した各試料にすぐにラベルを貼付
し、力価測定用に-80℃で保存した。



                            表1. 評価した処理

            ウイルス量       曝露時間(分)             処理

               1x105    15、30、60、120、
                                            RESPR HVAC
            PFU/200µL   360、720、1440、
                        および2880




 ウイルス不活化の定量
回収したウイルス懸濁液を二つ組の混合プレートで希釈し(10倍、3段階:1/10、1/100、1/1000)、Vero
E6を接種した96ウェルプレートに加えた。プレートを37℃で1時間培養した。接種液を捨て、2%カルボ
キシメチルセルロースオーバーレイを加え、37℃で24時間培養した。次にオーバーレイを捨ててプレー
トを洗浄し、-20℃で10分間固定した(アセトン-メタノール溶液を使用)。固定後、プレートをPBS-Tで2
回洗浄し、一次抗体(ヒト抗コロナウイルスIgG抗体、1:2000)を加え、37℃で一晩培養した。その後一次
抗体を捨て、プレートをPBS-Tで2回洗浄した。二次抗体(HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体、1:2000)を加え、
37℃で2時間培養した。二次抗体の除去後、プレートをPBS-Tで2回洗浄し、色素原基質によりプラーク
を形成させた。Immunospot Image分析器でプラークをカウントし、オープンソースソフトウェアのViridot
によりウイルス力価を測定した。力価減少率を以下の式を用いて計算した。
                                        (𝐴 − 𝐵) 𝑥 100
                    減少率 =
                                              𝐴
        ここで:Aは未処理(対照)のウイルス力価または初期力価;Bは処理後のウイルス力価。




                                                                                                      3
                                                                                                    School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory




結果

ウイルス力価は予想通り時間経過とともに減少した。平均値を表1および図1に報告している。感染から
24時間(1440分)後、力価は45FFU/mLまで低下した。

表1. RESPR HVAC装置に曝露された24mm×24mmアルミ箔片から、感染後の様々な時点(0~2880分)で採取
                されたSARS-CoV-2接種ウイルスの平均力価および標準偏差。

                                                                      平均
                                              時間(分)                (FFU/mL) DS
                                                0                     5060  479.4789
                                                15                    3740  396.6106
                                                30                    3410  939.8404
                                                60                  2456.67 1045.482
                                               120                  1246.67 228.9833
                                               360                  110.333 127.0171
                                               720                    57.67 63.50853
                                               1440                  45.333     0
                                                    2880                10.67                  0


             6×103




             4×103
      力価(FFU/mL )
      (FFU/mL)




             2×103




                    0
                        0

                            160

                                  320

                                        480

                                              640

                                                     800

                                                           960



                                                                        1280

                                                                               1440

                                                                                      1600

                                                                                             1760

                                                                                                     1920

                                                                                                            2080

                                                                                                                   2240

                                                                                                                          2400

                                                                                                                                 2560

                                                                                                                                        2720

                                                                                                                                               2880
                                                                 1120




                                                                         時間(分)


図1. RESPR HVAC装置に曝露された24mm×24mmアルミ箔片から、感染後の様々な時点(0~2880分)で採取
                されたSARS-CoV-2接種ウイルスの平均力価および標準偏差。



                                                                                                                                                        4
                                      School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory


        6
初期接種液(𝑋=5.06×103PFU/mL)との比較で計算したSARS-CoV-2力価の総減少量は、1440分間の
曝露後に99.991%に達した(図3)。
     SARS-CoV-2 力価の総減少量(%)




                             時間(分)



図3. RESPR HVAC装置に曝露された24mm×24mmアルミ箔片から、感染後の様々な時点(0~2880分)で採取さ
                   れたSARS-CoV-2接種ウイルスの総減少量(%)。



結論

RESPR HVAC装置の使用中、1440分間の曝露後にアルミニウム表面のSARS-CoV-2感染粒子の
最大99.991%の低減が得られた。この低減分の97.8%超は初回曝露の360分後に検出された。
                                                                                           School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory


(原文)                                                          REPORT:

   SARS-CoV-2 inactivation on aluminum surfaces by RESPR HVAC device
                                                Cristhian Salas - Jorge Osorio

                                                               12/08/2020



                                                               ABSTRACT

Designing effective methods of SARS-CoV-2 inactivation that can be applied in daily
human activities can help diminish the transfer and spread of infectious diseases such as
COVID-19. RESPR technology has shown to be effective in reducing pathogens and
allergens from the air and from surfaces. It is used in devices that release oxidizing
particles to purify the air that people inhale. We tested the SARS-CoV-2 inactivation
efficacy of a RESPR HVAC device at different exposure times on aluminum surfaces. A
plaque assay was used to measure SARS-CoV-2 titers after 8 different exposure time
points (from 10 minutes to 2880 minutes) with the presence of the device. The RESPR
HVAC device showed a reduction of 99.991% of the SARS-CoV-2 infectious particles on
the aluminum surface after 1440 minutes.



                                                       TABLE OF CONTENTS

ABSTRACT .................................................................................................................................. 1
MATERIALS AND METHODS ....................................................................................................... 1
      Materials infection and sample collection ...................................................................... 1
      Viral-inactivation quantification ....................................................................................... 2
      Data analysis ...................................................................................................................... 3
RESULTS ...................................................................................................................................... 3
CONCLUSIONS .......................................................................................................................... 4


MATERIALS AND METHODS

    Materials infection and sample collection
RESPR HVAC device was placed inside a Biosafety cabinet (BSC) and turned on. Sterile
aluminum foil pieces of 24mm x 24mm previously disinfected with 70% ethanol and
exposed to UV light for 25 minutes, were individually placed in a petri dish inside the BSC
and were kept at room temperature. A 200µl inoculum of 1 x 105 PFU of SARS-CoV-2 was
placed and extended on each aluminum piece using a micropipette tip. Three replicates
were prepared per treatment and enough samples were prepared to evaluate 8
exposure times (15, 30, 60, 120, 360, 720, 1440 and 2880 minutes) (Table 1).
                                                                            School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory


Following each exposure time, 2ml of collection media (DMEM with 2%FBS) was added
to each petri dish, making an initial dilution of 1:11, and the aluminum material was
washed out by resuspending four to five times using a micropipette; the viral suspension
was collected, mixed for homogeneity and aliquoted into 1ml centrifuge tubes. Each
collected sample was immediately labeled and stored at -80°C for titration assays.


                                         Table 1. Evaluated treatments

                         Virus dose         Exposure time (min)        Treatment

                             1x105          15, 30, 60, 120, 360,
                                                                       RESPR HVAC
                           PFU/200µl        720, 1440 and 2880




   Viral-inactivation quantification
The recovered virus suspension was diluted (10-fold, 3 dilutions: 1/10, 1/100, 1/1000) in a
mixing plate in duplicate and added to 96 well Vero E6 seeded plates. Plates were
incubated for 1 hour at 37°C. Inoculum was discarded and a 2% carboxymethylcellulose
overlay was added and incubated for 24 hours at 37°C. Next, the overlay was discarded,
plates washed and fixed for 10 minutes at -20°C (using acetone-Methanol solution).
Following fixation, plates were washed two times with PBS-T and a primary antibody (IgG
Human anti-Coronavirus, 1:2000) was added and incubated overnight at 37°C. The
primary antibody was then discarded, and plates were washed twice with PBS-T. A
secondary antibody (Goat IgG Anti-Human HRP conjugated, 1:2000) was added and left
to incubate for 2 hours at 37°C. After removing the secondary antibody, plates were
washed twice with PBS-T and plaques were developed with a Chromogen substrate.
Plaques were counted using Immunospot Image analyzer and open-source software
Viridot to determine the viral titer. The titer reduction percentage was calculated using
the following formula:
                                                    (𝐴 − 𝐵) 𝑥 100
                              𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 =
                                                          𝐴
Where: A is the virus titer with no treatment (Control) or the initial titer; and B is the viral titer after treatment.
                                                                                                            School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory




RESULTS

Viral titers decreased with time as expected, mean values are reported in table 1 and
Figure 1; 24 hours after infection (1440 minutes) the titer was reduced up to 45 FFU/mL.
Table 1. Mean titers and standard deviation of SARS-CoV-2 inoculum collected at different time
points (from 0 to 2880 minutes) after infection from 24mm x 24mm aluminum foil pieces exposed
                                    to a RESPR HVAC device.

                                                                             Mean
                                                       Time (m)            (FFU/mL)                DS
                                                           0                  5060              479.4789
                                                          15                  3740              396.6106
                                                          30                  3410              939.8404
                                                          60                2456.67             1045.482
                                                          120               1246.67             228.9833
                                                          360               110.333             127.0171
                                                          720                57.67              63.50853
                                                         1440                45.333                 0
                                                         2880                10.67                  0



                         6×103




                         4×103
          Titer FFU/ml




                         2×103




                            0
                                 0

                                     160

                                           320

                                                 480

                                                       640

                                                             800

                                                                   960



                                                                                1280

                                                                                       1440

                                                                                              1600

                                                                                                     1760

                                                                                                             1920

                                                                                                                    2080

                                                                                                                           2240

                                                                                                                                  2400

                                                                                                                                         2560

                                                                                                                                                2720

                                                                                                                                                       2880
                                                                         1120




                                                                                Time (min)


Figure 1. Mean titers and standard deviation of SARS-CoV-2 inoculum collected at different time
points (from 0 to 2880 minutes) after infection from 24mm x 24mm aluminum foil pieces exposed
                                    to a RESPR HVAC device.
                                                                                                                                                  School of Veterinary Medicine – Osorio Laboratory


The total reduction of SARS-CoV-2 titer, calculated in relation to the initial inoculum
(𝑋=5.06x103 PFU/ml), reached 99.991% after 1440 minutes of exposure (Figure 3).
 6



                                        110

                                        100

                                             90
      Total SARS-CoV-2 titer reduction (%)




                                             80

                                             70

                                             60

                                             50

                                             40

                                             30

                                             20

                                             10

                                             0
                                                     120
                                                           240
                                                                 360
                                                                       480
                                                                             600
                                                                                   720
                                                                                         840
                                                                                               960
                                                                                                     1080
                                                                                                            1200
                                                                                                                    1320
                                                                                                                           1440
                                                                                                                                  1560
                                                                                                                                         1680
                                                                                                                                                 1800
                                                                                                                                                        1920
                                                                                                                                                               2040
                                                                                                                                                                      2160
                                                                                                                                                                             2280
                                                                                                                                                                                     2400
                                                                                                                                                                                            2520
                                                                                                                                                                                                   2640
                                                                                                                                                                                                          2760
                                                                                                                                                                                                                 2880
                                                 0




                                                                                                                   Time (min)
                                                     Time (m)               15              30             60                120                  360            720                1440             2880
                                                     Mean( %)            25.96           33.04          50.97              75.44                91.89          94.97                94.28           97.81
                                                     SD                   6.73           14.73          23.01               3.27                 3.08           0.74                 5.00             0.20


Figure 3. Total reduction (%) of SARS-CoV-2 inoculum collected at different time points (from 0 to
2880 minutes) after infection from 24mm x 24mm aluminum foil pieces exposed to a RESPR HVAC
                                              device.



CONCLUSIONS

While using the RESPR HVAC device, a maximum reduction of 99.991% of SARS-CoV-2
infectious particles on an aluminum surface was reached after 1440 minutes of
exposure. More than 97.8% of this reduction was detected 360 minutes after the initial
exposure.